Enzimkinetikai vizsgálatok folyamatos áramlású Lab-on-a-Chip mikrokaloriméterhez

OData támogatás
Konzulens:
Dr. Ender Ferenc
Elektronikus Eszközök Tanszéke

A diplomamunka során egy Lab-on-a-chip alapú mikrokalorimetriás készülék tervezésébe kapcsolódtam be, melyhez diagnosztikai szempontból ígéretes fenilalanin ammónia-liáz (PAL) valamint dezoxi-uridin-trifoszfát nukleotidhidroláz (dUTPáz) enzimek termeltetését, tisztítását, karakterizálását terveztem el. Feladatom volt olyan nagytisztaságú aktív és inaktív (szubsztrátkötésében nem perturbált, ám a konverzióban gátolt) enzimek megtervezése és előállítása, melyek alkalmasak lehetnek immobilizálási kísérletek, izotermális titrációs kaloriméter, valamint termostabilitás és aktivitásmérési vizsgálatok elvégzéséhez.

Az enzimek kiválasztása során figyelembe vettem azok diagnosztikai potenciálján túl a szakirodalomban talált kinetikai adatokat és stabilitási tulajdonságokat a szerkezet függvényében, s elvégeztem az így kiválasztott enzimek heterológ expresszióját az expressziós vektoroknak megfelelő E.coli gazdatörzsekben. Az így nyert fehérjéket sejtfeltárás után nikkel-nitrilo-triecetsav affinitáskromatográfiával tisztítottam (Ni-NTA), s a tisztított enzimpreparátumokkal aktivitásvizsgálatot végeztem. Az irodalmazási feladat során gyűjtött adatok alapján a PAL enzimekkel történő vizsgálatokat helyeztük előtérbe, mivel a tervezett immobilizációs célokra a dUTPáz enzimek nem tűntek előnyösnek. Vizsgáltam a PAL enzimek viselkedését a szubsztrátkoncentráció függvényében adott hőmérsékleten a kinetikai paraméterek meghatározása érdekében, valamint a aktivitás pH-függését és a fehérjék termostabilitását is.

Homológia modell segítségével nyert szerkezetek és irodalmi adatok alapján megterveztem és expresszáltattam a szubsztrátkötésben nem perturbált, ám aktivitásában gátolt PAL pontmutánsokat, melyeket a továbbiakban az aktív enzimekkel megegyező módon és módszerekkel vizsgáltam. Az inaktív mutánsok a referenicaágban az aspecifikus hőjelek kiszűrésére szolgálhatnak. Expresszáltattam egy stabilitás szemponjából ígéretes, bioinformatikai adatok alapján megtervezett kiméra PAL enzimet is, melyben egy eukarióta enzimben a C-terminális multihélix régiót egy rövidebb bakteriális szegmensre cseréltünk le.

Enzimrögzítési célokra nagy mennyiségű tiszta fehérjepreparátumokat készítettem, hogy az immobilizált enzimkészítmények is vizsgálhatóak legyenek.

Letölthető fájlok

A témához tartozó fájlokat csak bejelentkezett felhasználók tölthetik le.