Új cytotoxicitási módszer kidolgozása szöveti őssejteken; áramlási citometriás (FACS) és fluorimetriás módszer összevetése

OData támogatás
Konzulens:
Dr. Szlávecz Ákos
Irányítástechnika és Informatika Tanszék

Gyógyszerfejlesztést végző gyárak, illetve biotechnológiai cégek a gyógyszerjelölt molekulák kiválasztásának egyik kezdeti lépéseként, laboratóriumi sejttenyészeteken vizsgálják molekuláik sejtekre gyakorolt hatását. Szövettenyésztő edényeken nevelt sejtkultúrákat tenyésztenek a tesztelni kívánt vegyület jelenlétében, majd alkalmas módszerrel mérik a sejtek szaporodását, esetleg valamilyen kiemelt funkcióját. Hasonló módszerek alkalmasak egyben annak kimutatására is, hogy egy gyógyszer, mennyire mutat toxikus hatásokat, mellékhatásokat. Ez utóbbi vizsgálatoknál, amelyeket toxikológia néven szokás emlegetni, főként az egészséges szövetekre gyakorolt hatás vizsgálata az elsődleges célpont.

Munkám során mérőrendszereket dolgoztam ki és hasonlítottam össze daganatos sejtek szaporodását befolyásoló vegyületek hatásának tesztelésére, azaz ún. citotoxicitási vizsgálómódszert állítottam be. Ugyanezeket a mérési eljárásokat alkalmazva kíséreltem meg egy hatékony, már forgalomban levő kemoterápiás szer – mitoxantron (Mx) - mint „minta-vegyület”, toxikus hatásának elemzését az emberi szervezetben előforduló egészséges szöveti őssejtekre, mezenchimális őssejtekre. Ez utóbbi mérést toxicitási vizsgálómódszerként értelmezem.

Az elvégzett mérések során, alkalmaztam a laboratóriumban korábban létrehozott, fluoreszcens indikátorfehérjét kifejező sejtvonalakat. A daganatos modell-sejtvonal (PLB985), amelyet 15 éve egy mieloid leukémiás betegből hoztak létre orvos-kutatók, piros fluoreszcens fehérjét (mCherry) fejez ki stabilan. Az egészséges szöveti mezenchimális őssejtet emberi zsírszövetből izolálták (Zs-MSC), majd zöld fluoreszcens fehérjét (eGFP) kódoló gént juttattak a genomjába.

Az egyik kidolgozott módszer, a fluoreszcens fehérjék jelintenzitásának detektálása, mely hűen tükrözi a sejtek számának változását. E technikával nyert mérési eredményeket vetettem össze a hagyományos resazurin redukciós méréssel, amely a sejtek szaporodását, redox reakcióval detektálja. A kétféle módszer eredményeinek összevetéséből leolvasható a daganatos sejteket pusztító, az egészséges őssejtek osztódását azonban nem befolyásoló drog dózis (IC50 érték). Az eredmények azt mutatják, hogy az egészséges szövetből származó mezenchimális őssejtek ellenállóbbak a Mx kemoterápiás szerrel szemben, mint a korai sejtérési stádiumban elakadt csontvelői, vérképző rákos sejtvonal. Megfigyeléseink szerint, a daganatos sejtekre a Mx már alacsony koncentrációban, (IC50:11 nM) korábban kifejti hatását (4. nap), míg az őssejtek, in vitro körülmények között, jóval kevésbé érzékenyek a kezelésre, IC50: 59 nM), és minthogy ez utóbbiak lassabban osztódnak, a gátló hatás kialakulása csak 6 nap inkubálás után jelentkezik stabilan.

Munkám második fázisában, a két vizsgált sejt kölcsönhatását kokultúrában és egymás felülúszó tápoldatában növesztve vizsgáltam a fent leírt módszerek alkalmazásával. A kísérletek során, míg a daganatos sejtek száma, az MSC jelenlétében, a sejtaránytól függően csökkent, addig az MSC mennyisége a daganatsejtek jelenlétében ugyanúgy szaporodott, mint azok jelenléte nélkül. A daganatsejtek felülúszója viszont statisztikailag jelentős mértékben (p=0,003) növelte az MSC drogtűrését (IC50: 73 nM-ról 160 nM-ra emelkedett). Az MSC-kultúrákról gyűjtött felülúszó is fokozta a daganatsejtek drogrezisztenciáját (IC50: 32 nM-ről 41 nM-ra), de ez az eredmény további megerősítésre szorul.

Letölthető fájlok

A témához tartozó fájlokat csak bejelentkezett felhasználók tölthetik le.